胚胎干細胞基質(zhì)膠的準(zhǔn)備和存儲需嚴(yán)格遵循溫度控制、無菌操作及分裝規(guī)范，以下是具體步驟和注意事項：

　　一、存儲條件

　　1.長期保存

　　溫度：-20℃或-80℃（推薦-80℃以減少溫度波動影響）。

　　位置：避免放置在冰箱門側(cè)，防止反復(fù)開關(guān)導(dǎo)致溫度不穩(wěn)定；優(yōu)先選擇內(nèi)側(cè)角落。

　　狀態(tài)：含酚紅基質(zhì)膠冷凍時為淡黃色/橙黃色，解凍后為紅色；不含酚紅者冷凍時呈碎冰樣白色，解凍后為半透明濃稠濁液（高濃度）或近乎透明（低濃度）。

　　2.運輸要求

　　需干冰運輸，確保全程低溫，防止基質(zhì)膠提前成膠或變質(zhì)。

　　二、胚胎干細胞基質(zhì)膠解凍與分裝

　　1.解凍步驟

　　一次解凍：將基質(zhì)膠包裝瓶半埋于碎冰中，置于2-8℃冰箱過夜，直至全融化。

　　后續(xù)使用：每次取出所需量后立即放回-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

　　2.分裝操作

　　預(yù)冷耗材：將1.5mLEP管、移液槍頭、離心管等置于-20℃冰箱預(yù)冷1小時以上。

　　冰上操作：所有分裝步驟需在冰上進行，防止基質(zhì)膠因溫度升高而聚合。

　　3.分裝方法：

　　用預(yù)冷的移液器將融化的基質(zhì)膠分裝至預(yù)冷的EP管中。

　　分裝時可用無菌剪刀剪去吸頭端，每分裝5管后更換新吸頭，減少堵塞風(fēng)險。

　　保存：分裝后的基質(zhì)膠迅速轉(zhuǎn)移至-20℃或-80℃冰箱保存。

　　三、胚胎干細胞基質(zhì)膠使用前準(zhǔn)備

　　1.稀釋基質(zhì)膠

　　稀釋液：常用無血清培養(yǎng)基或PBS。

　　比例：根據(jù)實驗需求調(diào)整稀釋比例，但稀釋后濃度不可低于4mg/ml，以保證成膠性能。

　　操作：將預(yù)冷的稀釋液加入解凍的基質(zhì)膠中，反復(fù)吹打混勻（至少20次），避免產(chǎn)生氣泡。

　　2.包被培養(yǎng)板

　　操作：

　　將稀釋后的基質(zhì)膠均勻鋪于培養(yǎng)板底部，輕輕搖晃使分布均勻。

　　置于37℃培養(yǎng)箱孵育30分鐘至1小時，使基質(zhì)膠聚合形成三維膠質(zhì)結(jié)構(gòu)。

　　包被后的培養(yǎng)板可密封后置于4℃保存，兩周內(nèi)使用；使用前需恢復(fù)至室溫30分鐘以上。

　　四、注意事項

　　1.溫度敏感：基質(zhì)膠在10℃以上會逐漸成膠，操作時需全程冰上進行，且所有試劑耗材需預(yù)冷。

　　2.無菌操作：所有步驟需在生物安全柜內(nèi)進行，避免污染。

　　3.避免沉淀：若解凍后基質(zhì)膠出現(xiàn)少量沉淀，可4℃低速離心后使用，通常不影響活性。

　　4.濃度控制：稀釋后濃度過低（<4mg/ml）可能導(dǎo)致成膠失敗，需嚴(yán)格按比例稀釋。

　　5.細胞混合：若需將細胞與基質(zhì)膠混合（如皮下成瘤實驗），需在冰上操作并盡快使用，防止基質(zhì)膠聚合影響細胞分布。